🧬Next-Generation Sequencing

次世代定序(Next-Generation Sequencing, NGS)是一種高通量 DNA/RNA 序列定序技術,能在短時間內產出大量資料,應用於基因體學、轉錄體學、腫瘤分析、微生物定序等多個領域。


1. NGS 與傳統定序的差異

項目
傳統 Sanger 定序
NGS(次世代定序)

產出量

單一序列

每次數百萬條序列

成本與時間

相對低廉且快速

應用範圍

基因驗證、小規模分析

全基因組、轉錄體、大規模分析


2. NGS 工作流程

(1) 样本準備

  • 提取 DNA 或 RNA

  • 建立定序資料庫(library):加入接頭(adapters)、酶切或 PCR 擴增

(2) 定序(Sequencing)

  • 使用平台如 Illumina、Ion Torrent、Nanopore

  • 根據技術不同產生短讀(short reads)或長讀(long reads)

(3) 資料處理(Bioinformatics)

  • 質控(Quality Control):如 FastQC

  • 比對(Alignment):如 BWA、STAR、HISAT2

  • 變異檢測(Variant Calling):如 GATK、FreeBayes

  • 表現量分析(Expression Quantification):如 featureCounts、Salmon

  • 可視化與統計分析:如 IGV、R/Seurat


3. 常見 NGS 應用

應用類型
說明

Whole Genome Sequencing (WGS)

完整基因體定序

Whole Exome Sequencing (WES)

只定序編碼區(外顯子)

RNA-seq

分析基因表現量與轉錄變異

Small RNA-seq

分析 miRNA、siRNA 等小分子 RNA

Single-cell RNA-seq

單細胞層級分析轉錄體

ChIP-seq

分析蛋白質與 DNA 的結合區域(如轉錄因子)


4. NGS 平台比較

平台
讀長類型
優點
缺點

Illumina

短讀

高準確率、高通量

難以分析重複區域

Oxford Nanopore

長讀

可即時分析、便攜裝置

錯誤率較高

PacBio

長讀

讀長穩定、適合全長轉錄本分析

成本較高


5. 資料儲存格式

格式
說明

FASTQ

原始讀取資料,包含序列與品質分數

BAM/SAM

對齊結果,SAM 為文字,BAM 為二進位格式

VCF

變異資料格式(如 SNP、INDEL)

GTF/GFF

基因註解格式


NGS 技術已成為現代生物醫學研究與精準醫療的重要支柱。掌握其流程與應用對於從事基因體與轉錄體研究至關重要。

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