🧬Next-Generation Sequencing
次世代定序(Next-Generation Sequencing, NGS)是一種高通量 DNA/RNA 序列定序技術,能在短時間內產出大量資料,應用於基因體學、轉錄體學、腫瘤分析、微生物定序等多個領域。
1. NGS 與傳統定序的差異
產出量
單一序列
每次數百萬條序列
成本與時間
高
相對低廉且快速
應用範圍
基因驗證、小規模分析
全基因組、轉錄體、大規模分析
2. NGS 工作流程
(1) 样本準備
提取 DNA 或 RNA
建立定序資料庫(library):加入接頭(adapters)、酶切或 PCR 擴增
(2) 定序(Sequencing)
使用平台如 Illumina、Ion Torrent、Nanopore
根據技術不同產生短讀(short reads)或長讀(long reads)
(3) 資料處理(Bioinformatics)
質控(Quality Control):如 FastQC
比對(Alignment):如 BWA、STAR、HISAT2
變異檢測(Variant Calling):如 GATK、FreeBayes
表現量分析(Expression Quantification):如 featureCounts、Salmon
可視化與統計分析:如 IGV、R/Seurat
3. 常見 NGS 應用
Whole Genome Sequencing (WGS)
完整基因體定序
Whole Exome Sequencing (WES)
只定序編碼區(外顯子)
RNA-seq
分析基因表現量與轉錄變異
Small RNA-seq
分析 miRNA、siRNA 等小分子 RNA
Single-cell RNA-seq
單細胞層級分析轉錄體
ChIP-seq
分析蛋白質與 DNA 的結合區域(如轉錄因子)
4. NGS 平台比較
Illumina
短讀
高準確率、高通量
難以分析重複區域
Oxford Nanopore
長讀
可即時分析、便攜裝置
錯誤率較高
PacBio
長讀
讀長穩定、適合全長轉錄本分析
成本較高
5. 資料儲存格式
FASTQ
原始讀取資料,包含序列與品質分數
BAM/SAM
對齊結果,SAM 為文字,BAM 為二進位格式
VCF
變異資料格式(如 SNP、INDEL)
GTF/GFF
基因註解格式
NGS 技術已成為現代生物醫學研究與精準醫療的重要支柱。掌握其流程與應用對於從事基因體與轉錄體研究至關重要。
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