# 1.16s\_rRNA.md

16S rRNA 定序是一種廣泛應用於微生物分類與鑑定的分子技術，透過分析細菌核糖體小次單元（16S ribosomal RNA）基因的變異區（variable regions），可辨識樣本中微生物的種類與豐度。

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## 一、16S rRNA 基因概述

* 存在於所有細菌及古菌的核糖體基因中，長度約 1,500 bp
* 包含高度保守區與九個變異區（V1～V9）
* 保守區：設計引子用以擴增目標區段
* 變異區：提供物種鑑定所需的序列差異

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## 二、16S rRNA 定序流程

1. **樣本採集與 DNA 萃取**：從腸道、口腔、環境等來源獲得微生物總 DNA
2. **PCR 擴增**：以保守區為標的，擴增特定變異區（常見如 V3–V4 區段）
3. **文庫建構與定序**：建構定序文庫，通常使用 Illumina MiSeq 執行雙端定序（PE 250 或 PE 300）
4. **資料分析**：包含過濾低品質序列、去除嵌合體、OTU/ASV 分群與分類註解

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## 三、資料分析流程（常用工具）

| 分析步驟        | 說明                       | 常用工具                 |
| ----------- | ------------------------ | -------------------- |
| 品質控制        | 過濾低品質序列、去除接頭序列           | FastQC、Trimmomatic   |
| 去除嵌合體       | 去除因 PCR 錯誤產生的假序列         | VSEARCH、UCHIME       |
| 分群（OTU/ASV） | OTU：97% 相似度群聚；ASV：單一序列單位 | QIIME2、DADA2         |
| 物種註解        | 比對參考資料庫，進行分類鑑定           | SILVA、Greengenes、RDP |
| 多樣性分析       | α 多樣性（樣本內）、β 多樣性（樣本間）    | QIIME2、Phyloseq（R）   |

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## 四、應用領域

* **腸道菌相分析**：研究人類或動物腸道微生物組成
* **環境微生物監測**：河川、水源、土壤中的細菌組成調查
* **臨床應用**：感染源追蹤、腸道失衡與疾病相關性分析
* **食品發酵**：菌種鑑定與發酵品質監控

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## 五、16S 定序優缺點

### 優點：

* 成本低、技術成熟、操作流程標準化
* 適用於未知菌種初步鑑定與群落結構概覽

### 限制：

* 無法解析至菌株或功能層級
* 引子偏好性可能導致某些物種低估或忽略
* 僅限細菌與古菌，無法涵蓋病毒與真菌

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16S rRNA 定序是微生物群落研究的入門技術，具高通量、易操作等優勢，適合大規模樣本菌相結構分析，但若需深入功能分析或物種解析，則建議進一步搭配全基因體定序（WGS）或宏基因體定序（Metagenomics）。
