FASTQ Format

FASTQ 格式是次世代定序（NGS）中最常見的原始輸出格式之一，用於儲存每筆定序讀段（read）的核酸序列及其對應的品質分數。此格式結合了 FASTA 格式的序列資訊與品質值資訊，便於後續分析。

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一、FASTQ 結構說明

每筆讀段使用四行表示，其格式如下：

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATTTTGGGTTTAAAGGGTGCCCGATAG
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

四行分別意義：

1. 第一行：以 @ 開頭，後接讀段識別碼（ID），可包含來源樣本、流道（lane）、定序方向等資訊。

2. 第二行：實際的核酸序列，由 A/T/C/G/N 組成。

3. 第三行：分隔符號，以 + 開頭，後方可重複第一行的 ID，也可留空。

4. 第四行：品質分數（Phred Quality Score），每個字元代表對應序列中該位置的品質分數，以 ASCII 字元編碼。

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二、Phred 品質分數（Phred Quality Score）

品質分數用來表示定序儀對該鹼基辨識的信心水準。公式如下：

Q = -10 * log10(P)

其中：

• Q 為 Phred 分數

• P 為該鹼基被錯誤辨識的機率

範例：

Phred Q 值	錯誤機率（P）	ASCII 字元（Phred+33 編碼）
10	1 in 10	+
20	1 in 100	5
30	1 in 1000	?
40	1 in 10000	I

註：Illumina 平台常使用 Phred+33 編碼（ASCII 33~73）。

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三、ASCII 編碼與 Phred 分數對照表（Phred+33）

ASCII 字元	ASCII 編碼值	對應 Phred 分數
!	33	0
"	34	1
#	35	2
$	36	3
%	37	4
&	38	5
'	39	6
(	40	7
)	41	8
*	42	9
+	43	10
,	44	11
-	45	12
.	46	13
/	47	14
0	48	15
1	49	16
2	50	17
3	51	18
4	52	19
5	53	20
6	54	21
7	55	22
8	56	23
9	57	24
:	58	25
;	59	26
<	60	27
=	61	28
>	62	29
?	63	30
@	64	31
A	65	32
B	66	33
C	67	34
D	68	35
E	69	36
F	70	37
G	71	38
H	72	39
I	73	40

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四、FASTQ 變體與壓縮格式

• 變體：根據不同平台或歷史版本，可能出現 Phred+64 編碼（較舊）與 Phred+33 編碼（現行標準）

• 壓縮格式：大部分 FASTQ 檔案會使用 gzip 壓縮，副檔名為 .fastq.gz

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五、應用與注意事項

應用：

• 原始序列品質評估（使用 FastQC）

• 資料剪裁與過濾（使用 Trimmomatic、Cutadapt）

• 後續比對與定量分析的輸入格式

注意事項：

• FASTQ 檔案通常體積龐大，建議壓縮儲存

• 不同平台輸出格式可能略有差異，分析前需確認編碼方式

• 品質分數分析是確保資料準確性的第一步

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FASTQ 檔案是 NGS 分析流程的起點，透過正確解讀與處理這些資料，可有效提升後續比對與變異分析的準確度。