Full-Length 16S rRNA Sequencing Analysis Pipeline

本文件說明從原始資料到進階統計分析的完整 16S rRNA 全長定序資料分析流程，並提供各步驟的簡要說明。

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1. 原始資料處理（Raw Data Processing）

ASV 產生（ASVs Generation）

• 品質過濾（Quality Filtering）：去除低品質讀段、修剪接頭與引子，以提升後續分析的準確度。

• 去噪（Denoising，使用 DADA2）：辨識並修正定序錯誤，產生唯一的 Amplicon Sequence Variants（ASVs），精確度高於傳統 OTUs。

註解（Annotation）

• 將 ASV 定序比對至微生物資料庫，進行分類學註解。

  • NCBI：通用參考庫。

  • GreenGenes：較舊但廣泛使用的分類庫。

  • SILVA：更新頻繁、分類精細，廣泛應用。

  • HOMD：人類口腔微生物專用資料庫。

  • UNITE：真菌 ITS 專用資料庫。

輸出：ASV 表格，包含每個樣本中出現的 ASVs 及其分類資訊。

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2. 下游分析模組（Downstream Analysis Modules）

Alpha 多樣性（Alpha Diversity，樣本內多樣性）

評估單一樣本中菌相的豐富度與均勻度。

• 多樣性指數：如 Shannon、Simpson、Chao1 等指標。

• 稀疏曲線（Rarefaction Curve）：評估測序深度與物種數之關係。

• 豐度排序圖（Rank Abundance Curve）：視覺化菌相分布。

• 物種累積曲線（Specaccum Curve）：反映發現新物種的速率。

• Shannon-Wiener 曲線：綜合反映豐富度與均勻性。

Beta 多樣性（Beta Diversity，樣本間差異）

比較樣本之間的菌相差異與群落結構。

• PCA / 3D PCA：線性降維分析。

• PCoA / 3D PCoA：基於距離矩陣（如 UniFrac）。

• NMDS：非參數排序方法。

• t-SNE：非線性降維，適用於高維資料。

• PLS-DA：監督式分群分析。

• UPGMA Tree：分層聚類法。

• UniFrac 距離盒狀圖：顯示演化關係差異。

系統發生分析（Phylogenetic Analysis）

• 演化樹構建（Phylogenetic Tree）：利用比對後序列建立菌株間的系統發生樹。

群落組成分析（Community Composition）

視覺化菌群豐度與結構。

• Venn / Upset Plot：比較組間共享與專一菌種。

• Heatmap：菌種相對豐度矩陣圖。

• 分類組成（Taxonomy Profile）：以柱狀圖呈現不同分類層級（門、屬等）。

• KRONA：互動式圓形分類圖。

• TreeMap / HeatTree：以區域大小或樹狀結構呈現豐度。

• Ternary Plot：三組樣本之間菌群差異視覺化。

關聯分析（Correlation Analysis）

分析菌種之間的共現或相互作用。

• Spearman 關聯分析：非參數相關檢定。

• 網絡分析（Network Analysis）：建立菌種間關聯圖譜。

• 相關熱圖（Correlation Heatmap）：顯示菌種間關係。

功能預測（Functional Prediction）

預測微生物群落可能的功能。

• PICRUSt2：基於 16S 資料推測代謝途徑。

• Tax4Fun：整合 SILVA 與 KEGG 進行功能注釋。

• FAPROTAX：針對生地化功能進行預測。

統計分析（Statistical Analysis）

進行統計檢定與生物標記探索。

• Kruskal-Wallis：非參數多組檢定。

• STAMP：簡易圖形化統計分析工具。

• ANCOM：針對組成性資料的差異分析。

• ALDEx2：貝式差異豐度分析法。

• LEfSe：LDA 為基礎的生物標誌物篩選方法。

• MetagenomeSeq：處理稀疏計數資料。

• Bubble Chart / Dominant Taxa：視覺化主要菌種變化。

• ANOSIM / MRPP / Adonis：多變量群組差異分析。

環境因子分析（Environment Factor Analysis）

探討環境或臨床變數與菌相的關聯。

• RDA / CCA / dbRDA：約束排序方法。

• Mantel Test：距離矩陣相關性分析。

• BioENV：篩選解釋變異的重要變項。

進階分析（Advanced Analysis）

• MicroPITA：找出具區辨力的核心菌種。

• Source Tracker：推測微生物來源（如糞便、皮膚等）。

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工具建議（Tools & Recommendations）

• QIIME2：完整工作流程工具，適合全流程分析。

• R 語言套件：如 phyloseq、vegan、microbiome 等，適合彈性視覺化與統計分析。

• Galaxy 平台：免程式操作，適合初學者。

• 模擬樣本：ZymoBIOMICS 等提供可重複測試用菌群，適合方法驗證。

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附註（Notes）

• 實驗設計應包含陰性與陽性對照。

• 分析時務必結合 metadata 資訊。

• 多次重複樣本有助於提高統計可靠性。

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若需練習數據，可參考 NCBI SRA、Qiita 資料庫，或向我們請求針對特定微生物群（如腸道、口腔、環境）模擬產生的 FASTQ 數據集。