ChIP-Seq

ChIP-Seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一種結合染色質免疫共沉澱與高通量定序的技術，用於研究 DNA 上與特定蛋白質（如轉錄因子、修飾組蛋白）結合的區域，揭示基因調控元件如啟動子、增強子等的活性狀態。

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一、技術原理

1. 交聯（Crosslinking）：使用甲醛將蛋白質與 DNA 結合處交聯。

2. 染色質剪碎：超音波或酶切法剪碎成 200–500 bp 的片段。

3. 免疫共沉澱（IP）：以抗體拉下特定蛋白質與其結合的 DNA 區段。

4. 交聯逆轉與 DNA 回收：去除蛋白質後回收純化 DNA。

5. 文庫建構與定序：進行末端修復、加接頭並執行高通量定序。

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二、應用範圍

• 偵測轉錄因子（TF）結合位點

• 探討組蛋白修飾（如 H3K27ac、H3K4me3）與染色質狀態

• 建構基因調控網絡與 enhancer landscape

• 分析細胞分化、發育過程與疾病機制中的調控變化

• 作為轉錄調控與表觀遺傳標誌的圖譜建構依據（如 ENCODE 計畫）

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三、資料分析流程

分析步驟	說明	常用工具
品質檢查	檢查原始 FASTQ 品質	FastQC、MultiQC
比對	將讀段對齊至參考基因組	BWA、Bowtie2
去除重複與排序	排除 PCR duplicate，排序 BAM 檔	Samtools、Picard
Peak calling	偵測顯著富集的片段區域（Peak）	MACS2、SICER
視覺化與註解	轉為 bigWig 載入 IGV，並與基因註解比對	deepTools、ChIPseeker（R）

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四、實驗設計建議

• 對照組：輸入 DNA（input）為必備對照，用以去除背景噪音。

• 抗體品質：需使用高專一性抗體，避免非特異性結合。

• 生物重複：至少 2–3 重複可提升資料可靠性。

• 讀段深度：轉錄因子建議 ≥ 20M，組蛋白修飾可達 ≥ 40M reads。

• 時間點與處理條件：針對動態調控研究（如刺激前後）應謹慎設計時間點與處理條件。

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五、優勢與挑戰

優勢：

• 可精確定位 DNA 上蛋白質結合位置

• 支援表觀遺傳與轉錄調控研究

• 可整合 RNA-seq、ATAC-seq 等多組學數據

• 可結合 CRISPR 技術探索調控元件功能（CRISPR interference + ChIP）

限制：

• 抗體品質與實驗變異影響結果可靠性

• 背景訊號高，需良好對照與正確 peak calling

• 較難解析非專一性、弱結合區域

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六、衍生技術簡介

1. ChIPmentation

• 將 Tn5 轉座酶應用於 ChIP 後 DNA 上進行接頭插入與建庫。

• 優點：流程簡化、建庫時間大幅縮短、適用低細胞量樣本。

2. CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）

• 利用蛋白 A/G 結合的微球核酸酶與抗體形成複合體，直接切割並釋放結合區域。

• 優點：背景低、解析度高、可使用極低細胞數（<10,000）。

• 已逐漸取代傳統 ChIP-Seq 成為新一代標準。

3. CUT&TAG（Cleavage Under Targets and Tagmentation）

• 將 CUT&RUN 與 Tn5 轉座整合，建庫更快速。

• 適合單細胞層級應用，並已發展出 scCUT&TAG。

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ChIP-Seq 是解碼基因調控元件與表觀遺傳修飾的關鍵技術，廣泛應用於發育生物學、癌症研究與藥物標靶發現領域，已成為基因體調控分析的標準工具之一。隨著衍生方法的出現，其靈敏度、解析度與應用場景也日益擴展。