11.Shotgun.md

宏基因體霰彈定序（Metagenomic Shotgun Sequencing）是一種高通量定序技術，能直接定序樣本中所有微生物（細菌、病毒、真菌、原蟲等）的基因體 DNA，不需培養或針對特定位點（如 16S）進行擴增。此方法可提供物種組成、功能潛能與抗藥基因等資訊，是微生物組學研究的重要工具。

---

一、與 16S rRNA 定序比較

項目	16S 定序	Shotgun 定序
偵測範圍	細菌（特定引子區段）	所有微生物（細菌、病毒、真菌等）
分辨率	多數只能到 genus	可到 species 或 strain level
功能資訊	無法偵測基因功能	可偵測基因功能與代謝潛能
資料需求	相對較小	資料量大，需更多儲存與運算資源

---

二、實驗流程概覽

1. 樣本處理與 DNA 萃取：環境樣本（如糞便、土壤、水）中的總 DNA 萃取。

2. 文庫建構：將 DNA 隨機打碎並加上接頭建庫。

3. 高通量定序：常用 Illumina NovaSeq/HiSeq 執行 PE150。

4. 資料產出與分析：取得原始 FASTQ 檔進行分析。

---

三、資料分析流程

分析步驟	說明	常用工具
品質控制	去接頭、剪除低品質序列	fastp、Trimmomatic
去宿主污染	去除人類或動物 DNA 讀段	Bowtie2（比對 hg38 或 host genome）
組裝與基因預測	組裝 contigs 並預測 ORF	MEGAHIT、SPAdes、Prodigal
物種分類	根據比對與 k-mer 對讀段或組裝片段進行分類	Kraken2、MetaPhlAn、Centrifuge
功能註解	分析代謝通路、抗藥性基因等功能單元	HUMAnN、EggNOG-mapper、CARD

---

四、應用場景

• 腸道微生物研究：解析人類腸道菌相的物種與功能組成

• 環境監測：水體、土壤、空氣樣本中微生物族群結構與污染監控

• 抗藥性基因分析：篩檢抗生素抗性基因（ARG）與流行性監測

• 感染源鑑定與臨床診斷：直接從臨床樣本中判斷致病菌

---

五、技術優勢與挑戰

優勢：

• 高解析度，可解析到物種甚至菌株層級

• 同時提供物種與功能層級資訊

• 適用於未知菌種與病毒的偵測

限制：

• 資料量龐大，分析需求高

• 成本高於 16S 定序

• 組裝與分類容易受到低豐度物種或宿主污染影響

---

宏基因體霰彈定序提供了全面性的微生物組分析能力，尤其在功能探索、疾病研究與環境微生物監控方面具備無可取代的價值，並與轉錄體、代謝體等多組學整合發展出更強大的解釋潛力。