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RNA-Seq（轉錄體定序）是一種運用次世代定序（NGS）平台進行 RNA 分析的技術，可用來偵測基因表現量、剪接異構體、融合基因、非編碼 RNA 等，在功能基因體學與轉錄體研究中應用廣泛。

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一、RNA-Seq 實驗流程

1. RNA 抽取與純化：從細胞或組織中萃取總 RNA，並去除 rRNA 或選擇 mRNA（polyA 篩選）

2. 反轉錄與建庫：將 RNA 轉錄為 cDNA，再加上接頭構建文庫

3. 定序平台執行：常用 Illumina 執行 PE150 雙端定序，產出 FASTQ 資料

4. 生物資訊分析：進行品質控制、比對、定量與差異分析等

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二、RNA-Seq 資料分析流程

分析步驟	說明	常用工具
品質檢查	評估原始資料品質	FastQC、MultiQC
去接頭與剪修	去除低品質鹼基與 adapter 序列	Trimmomatic、Cutadapt
參考比對	將 reads 對齊至參考基因組或轉錄體	STAR、HISAT2
表現量定量	依據對齊結果計算各基因/轉錄本的表現量	featureCounts、HTSeq-count
差異表現分析	分析不同條件間基因表現差異	DESeq2、edgeR、limma-voom
功能與路徑註解	GO enrichment、KEGG pathway 分析	clusterProfiler、DAVID、GSEA

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三、常見輸出與格式

• FASTQ：原始讀段序列與品質分數

• BAM/SAM：對齊結果

• count matrix：每基因在每樣本中的讀段數量表

• DE result：差異表現分析結果（logFC、p-value）

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四、RNA-Seq 應用領域

• 基因表現譜分析：不同處理或疾病狀態下的基因活性變化

• 癌症研究：探索腫瘤相關基因、融合轉錄本

• 幹細胞與分化：追蹤時間序列表現變化與細胞命運

• 疾病機制研究：找出疾病相關途徑與標誌基因

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五、技術優勢與限制

優勢：

• 可偵測未知基因、剪接變異、非編碼 RNA

• 高動態範圍，精準捕捉不同表現層級的基因

• 適合物種無參考基因組也可執行（de novo 組裝）

限制：

• 分析流程複雜、計算資源需求高

• 樣本品質（RNA 完整度）影響結果

• 無法直接反映蛋白質表現或活性

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RNA-Seq 是研究基因表現與轉錄體結構的強大工具，透過適當實驗設計與精確分析方法，能協助解答疾病機制、辨識生物標誌，並支援個人化醫療與精準治療的發展。