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16S rRNA 定序是一種廣泛應用於微生物分類與鑑定的分子技術，透過分析細菌核糖體小次單元（16S ribosomal RNA）基因的變異區（variable regions），可辨識樣本中微生物的種類與豐度。
一、16S rRNA 基因概述
存在於所有細菌及古菌的核糖體基因中，長度約 1,500 bp
包含高度保守區與九個變異區（V1～V9）
保守區：設計引子用以擴增目標區段
變異區：提供物種鑑定所需的序列差異
二、16S rRNA 定序流程
樣本採集與 DNA 萃取：從腸道、口腔、環境等來源獲得微生物總 DNA
PCR 擴增：以保守區為標的，擴增特定變異區（常見如 V3–V4 區段）
文庫建構與定序：建構定序文庫，通常使用 Illumina MiSeq 執行雙端定序（PE 250 或 PE 300）
資料分析：包含過濾低品質序列、去除嵌合體、OTU/ASV 分群與分類註解
三、資料分析流程（常用工具）
品質控制
過濾低品質序列、去除接頭序列
FastQC、Trimmomatic
去除嵌合體
去除因 PCR 錯誤產生的假序列
VSEARCH、UCHIME
分群（OTU/ASV）
OTU：97% 相似度群聚；ASV：單一序列單位
QIIME2、DADA2
物種註解
比對參考資料庫，進行分類鑑定
SILVA、Greengenes、RDP
多樣性分析
α 多樣性（樣本內）、β 多樣性（樣本間）
QIIME2、Phyloseq（R）
四、應用領域
腸道菌相分析：研究人類或動物腸道微生物組成
環境微生物監測：河川、水源、土壤中的細菌組成調查
臨床應用：感染源追蹤、腸道失衡與疾病相關性分析
食品發酵：菌種鑑定與發酵品質監控
五、16S 定序優缺點
優點：
成本低、技術成熟、操作流程標準化
適用於未知菌種初步鑑定與群落結構概覽
限制：
無法解析至菌株或功能層級
引子偏好性可能導致某些物種低估或忽略
僅限細菌與古菌，無法涵蓋病毒與真菌
16S rRNA 定序是微生物群落研究的入門技術，具高通量、易操作等優勢，適合大規模樣本菌相結構分析，但若需深入功能分析或物種解析，則建議進一步搭配全基因體定序（WGS）或宏基因體定序（Metagenomics）。
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