8.CHIP_seq.md
ChIP-Seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一種結合染色質免疫共沉澱與高通量定序的技術，用於研究 DNA 上與特定蛋白質（如轉錄因子、修飾組蛋白）結合的區域，揭示基因調控元件如啟動子、增強子等的活性狀態。
一、技術原理
交聯（Crosslinking）：使用甲醛將蛋白質與 DNA 結合處交聯。
染色質剪碎：超音波或酶切法剪碎成 200–500 bp 的片段。
免疫共沉澱（IP）：以抗體拉下特定蛋白質與其結合的 DNA 區段。
交聯逆轉與 DNA 回收：去除蛋白質後回收純化 DNA。
文庫建構與定序：進行末端修復、加接頭並執行高通量定序。
二、應用範圍
偵測轉錄因子（TF）結合位點
探討組蛋白修飾（如 H3K27ac、H3K4me3）與染色質狀態
建構基因調控網絡與 enhancer landscape
分析細胞分化、發育過程與疾病機制中的調控變化
作為轉錄調控與表觀遺傳標誌的圖譜建構依據（如 ENCODE 計畫）
三、資料分析流程
品質檢查
檢查原始 FASTQ 品質
FastQC、MultiQC
比對
將讀段對齊至參考基因組
BWA、Bowtie2
去除重複與排序
排除 PCR duplicate，排序 BAM 檔
Samtools、Picard
Peak calling
偵測顯著富集的片段區域（Peak）
MACS2、SICER
視覺化與註解
轉為 bigWig 載入 IGV，並與基因註解比對
deepTools、ChIPseeker（R）
四、實驗設計建議
對照組：輸入 DNA（input）為必備對照，用以去除背景噪音。
抗體品質：需使用高專一性抗體，避免非特異性結合。
生物重複：至少 2–3 重複可提升資料可靠性。
讀段深度：轉錄因子建議 ≥ 20M，組蛋白修飾可達 ≥ 40M reads。
時間點與處理條件：針對動態調控研究（如刺激前後）應謹慎設計時間點與處理條件。
五、優勢與挑戰
優勢：
可精確定位 DNA 上蛋白質結合位置
支援表觀遺傳與轉錄調控研究
可整合 RNA-seq、ATAC-seq 等多組學數據
可結合 CRISPR 技術探索調控元件功能（CRISPR interference + ChIP）
限制：
抗體品質與實驗變異影響結果可靠性
背景訊號高，需良好對照與正確 peak calling
較難解析非專一性、弱結合區域
六、衍生技術簡介
1. ChIPmentation
將 Tn5 轉座酶應用於 ChIP 後 DNA 上進行接頭插入與建庫。
優點：流程簡化、建庫時間大幅縮短、適用低細胞量樣本。
2. CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）
利用蛋白 A/G 結合的微球核酸酶與抗體形成複合體，直接切割並釋放結合區域。
優點：背景低、解析度高、可使用極低細胞數（<10,000）。
已逐漸取代傳統 ChIP-Seq 成為新一代標準。
3. CUT&TAG（Cleavage Under Targets and Tagmentation）
將 CUT&RUN 與 Tn5 轉座整合，建庫更快速。
適合單細胞層級應用，並已發展出 scCUT&TAG。
ChIP-Seq 是解碼基因調控元件與表觀遺傳修飾的關鍵技術，廣泛應用於發育生物學、癌症研究與藥物標靶發現領域，已成為基因體調控分析的標準工具之一。隨著衍生方法的出現，其靈敏度、解析度與應用場景也日益擴展。
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