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重亞硫酸鹽定序（Bisulfite Sequencing）是分析 DNA 甲基化狀態的黃金標準技術，透過將未甲基化的胞嘧啶（C）轉換為尿嘧啶（U，後續定序時表現為 T），而甲基化的胞嘧啶（5-mC）則保持不變，從而在單鹼基解析度下區分甲基化與非甲基化位點。

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一、技術原理

• 未甲基化 C：經重亞硫酸鹽處理後轉為 U，定序後表現為 T。

• 甲基化 C（5-mC）：不受處理影響，仍維持為 C。

• 比對分析：將處理後的序列與參考基因組比對，可推斷出原始甲基化狀態。

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二、實驗流程

1. DNA 萃取與純化：需高品質且完整的基因體 DNA。

2. 重亞硫酸鹽轉換：使用化學試劑處理 DNA，進行未甲基化 C → U 轉換。

3. 文庫建構與 PCR 擴增：轉換後的 DNA 經建庫與擴增，準備定序。

4. 高通量定序：通常採用 Illumina 平台進行短讀長定序（如 PE150）。

5. 資料產出：產出 FASTQ 檔供後續甲基化分析使用。

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三、資料分析流程

分析步驟	說明	常用工具
品質檢查	檢查定序品質、污染與 GC 偏差	FastQC、Trim Galore
特殊比對	允許 C→T 和 G→A 轉換下對齊參考序列	Bismark、BSMAP、BatMeth2
甲基化呼叫	計算每個 CpG 位點的甲基化比例（β 值）	Bismark methylation extractor
視覺化與統計分析	甲基化分佈圖、區域甲基化比較、熱圖繪製	IGV、methylKit（R）、MethGo

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四、常見應用類型

類型	說明	特點
WGBS	全基因體甲基化定序	資料量大，成本高，全面
RRBS	限制酶切富集 CpG 區域再定序	成本較低，適合探索性研究
Targeted	捕獲特定區域（如啟動子、基因座）	高深度，適用臨床檢測

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五、優勢與限制

優勢：

• 單鹼基解析度，可精確定位甲基化位點

• 可應用於多樣物種與樣本類型

• 與基因表現分析整合，可探討表觀調控機制

限制：

• DNA 處理步驟容易造成片段損傷與偏差

• 分析需特製比對工具與演算法，流程複雜

• 高覆蓋率需求導致成本相對較高

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重亞硫酸鹽定序技術在表觀遺傳學研究中扮演關鍵角色，特別適用於癌症、發育、免疫與環境反應等領域的甲基化機制探索，亦逐漸擴展至臨床診斷與精準醫療應用。