9.ATAC_seq.md
ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一種用於偵測染色質開放區域的高通量定序方法。透過 Tn5 轉座酶將接頭插入開放染色質區域，可捕捉活躍調控元件如啟動子與增強子的活性狀態，是研究染色質構造與基因調控的利器。
一、技術原理
細胞裂解與核分離：分離出細胞核以進行轉座反應。
Tn5 轉座反應：帶有定序接頭的 Tn5 轉座酶會插入可及性高的開放染色質區域。
PCR 擴增與文庫建構：擴增含接頭的片段以建構文庫。
高通量定序：常採用 Illumina 平台進行雙端定序。
二、應用範圍
比較不同細胞狀態下的染色質可及性差異
發掘轉錄調控元件如增強子、抑制子位置
整合 RNA-seq 與 ChIP-seq 資料推測調控網絡
單細胞層級染色質開放分析（scATAC-seq）
三、資料分析流程
品質檢查
檢查原始 FASTQ 品質
FastQC、MultiQC
去接頭與剪修
清理接頭序列與低品質區段
Trim Galore、cutadapt
比對
將 reads 對齊至參考基因組
Bowtie2、BWA
去除重複與雜訊
排除 PCR duplicates 與線粒體污染
Samtools、Picard
Peak calling
偵測染色質開放區域（Accessible region）
MACS2、Genrich
功能註解與視覺化
對開放區域進行功能註解與熱圖繪製
deepTools、ChIPseeker（R）
四、實驗設計建議
樣本品質：需確保細胞新鮮、完整性佳，避免染色質降解。
細胞數需求：一般建議使用 50,000–100,000 個細胞，亦可執行低細胞或單細胞版本。
轉座時間控制：過度轉座會增加背景與片段過短，需優化條件。
雙端定序建議：可更準確推估轉座位點與片段長度分佈。
五、片段長度與染色質結構解析
<100 bp：表示開放區域（nucleosome-free region）
~180 bp：單核小體保護區段
~360 bp：雙核小體保護區段
片段長度分佈圖可解析染色質結構資訊，是 ATAC-seq 的一大優勢。
六、優勢與限制
優勢：
無需抗體，可即時捕捉染色質開放狀態
操作流程簡單、時間短（1~2 天可完成）
解析度高，支援單細胞與多樣組織應用
限制：
資料含高比例線粒體 reads，需特別處理
背景雜訊可能受轉座條件與樣本品質影響
不提供蛋白質結合資訊，建議與 ChIP-Seq 整合解讀
七、單細胞 ATAC-Seq（scATAC-seq）
scATAC-seq 將傳統 ATAC-seq 技術應用至單一細胞層級，能夠解析細胞族群間的染色質開放差異與調控多樣性。
技術特色：
利用微流體平台（如 10x Genomics Chromium）將單細胞包覆並賦予細胞條碼。
每個細胞獨立記錄其染色質可及性訊號。
分析流程（延伸）：
條碼解碼與資料建構
產出 cell × peak matrix
Cell Ranger ATAC、ArchR
質量控制與過濾
根據 fragment 數與 TSS enrichment 過濾細胞
ArchR、Signac（Seurat）
降維與聚類分析
使用 LSI + UMAP 進行細胞分類與視覺化
ArchR、Signac
motif enrichment 分析
預測調控因子活性區域與調控 motif 富集
chromVAR、CisTopic
應用場景：
建構細胞命運分化軌跡圖譜
探索腫瘤微環境中的調控異質性
與 scRNA-seq 整合解讀細胞狀態與功能
ATAC-Seq 是快速且高解析的染色質結構分析工具，適用於細胞命運決定、基因調控研究與疾病標誌探索。結合其他轉錄與表觀組學技術（如 scRNA-seq、ChIP-seq、Hi-C），能進一步還原細胞內複雜的基因調控網絡，尤其單細胞技術的整合更成為未來研究趨勢。
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